更新时间：08-05 编辑老师：佚名
摘 要: 为了研究PEG胁迫对水稻生理特性的影响, 本实验以原种WT和转PEPC基因水稻为试验材料, 研究在PEG处理前、PEG处理后2个阶段的水稻幼苗叶片中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化氢酶（CAT）等保护酶系活性的变化及丙二醛 MDA 、叶绿素和光合速率变化。结果表明，在PEG处理后，转PEPC基因水稻幼苗体内的POD，SOD，CAT等保护酶的活性均比WT提高的幅度大，叶绿素的含量比WT来说相对多，但MDA的含量却比WT低。PEG处理后PEPC光合速率表现出比原种高。说明转PEPC光合酶基因水稻苗期表现出耐PEG胁迫的特性，这为水稻耐PEG育种提供了理论依据。
关键词：转基因水稻；PEG胁迫；光合速率；
引言
PEG胁迫常常影响植物生长发育,造成作物严重减产(Boyer ,1982) 。全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36 % ,占耕地面积的43 %。我国的干旱、半干旱地区主要分布在华北、西北、内蒙古和青藏高原等地区,其面积约占全国土地面积的二分之一。干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中占首位,仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。为了适应PEG胁迫,在长期的进化过程中,一些植物已经演化出了一套适应机制和策略。但是,许多重要农作物如水稻、烟草、土豆等对干旱非常敏感,缺乏有效的耐旱机理,经常因干旱造成严重的产量损失。因此,各国都在致力于培育耐旱农作物新品种。近年来,随着分子生物学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟,通过基因工程技术改良作物耐旱性出现了良好的势头。[1]
水稻(Oryza sa tica L. )是世界上最重要的粮食作物之一, 50% 以上的人口以稻米为主食。随着全球变暖的加剧,水资源短缺问题日益严重。干旱已成为水稻生产上长期存在的主要非生物胁迫, 干旱造成水稻的减产可超过其他因素引起减产的总和, 并且严重影响水稻的品质[2]。因此, 研究水稻抗旱机理, 提高水稻抗旱能力已经成为人们关注的重点。
80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状、外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。许多学者在水稻的转基因研究上做了大量工作并取得了很大的进展，为水稻的遗传改良奠定了基础。
PEG (聚乙二醇) 是一种亲水性很强的大分子有机物, 溶于水后能产生强大的渗透压, 因此PEG 常用作植物耐旱性选择剂或水分胁迫剂。近年来, 利用分子生物学手段研究植物抗旱性时常用一定浓度的PEG 溶液处理植株, 然后研究水分胁迫下的mRNA 差异表达或旱激蛋白的合成等, 进而研究植物的抗旱机理。1979 年首次以PEG 为诱导剂和筛选剂筛选出抗旱的烟草细胞系[3]; 以后, 相继出现的研究成果有: 把细胞放在含有PEG 的培养基中选到了抗干旱的番茄细胞[4]; 利用高粱种子经PEG 诱导产生的愈伤组织为材料获得了耐旱性强的再生植株并且收获了种子[5]。国内的研究也取得了一定进展, 用3 种途径获得抗PEG 胁迫而且抗性稳定的苜蓿细胞系[5,6] , 以PEG6000 作为耐旱性选择剂初步获得耐旱性甘薯植株[7]
在PEG胁迫条件下, 水稻的各种生理代谢过程发生了很大变化, 水稻植株的净光合速率、叶绿素含量及光合酶活性有所下降, 游离脯氨酸、脱落酸、活性氧和丙二醛的积累量明显增加, 抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化酶活性增强, 清除过量的活性氧, 减少对水稻的损伤, 耐旱性强的水稻品种可能具有更强的抗氧化能力。今后, 通过对与水稻抗旱有关的功能基因的转导和表达的研究, 从分子水平上探索水稻水分胁迫的内在机理并通过基因工程的方法培育出抗旱品种, 可以减少干PEG迫对水稻产量和品质的影响。
以粳稻品种Kitaake 为受体的转PEPC 基因水稻,由于C3光合途径中C4光合固碳基因的导入引起了一系列的变化。王仁雷等 (2002)[11]、Jiao 等 (2005)[12]和李霞等（2005a)[11]对转PEPC基因水稻材料的世代繁殖鉴定表明,与原种相比, 在高光强 (3 小时)或光氧化剂甲基紫精methylviologen, MV)处理后, 转PEPC 基因水稻的PSII光化学效率 (Fv/Fm)和光化学淬灭(qp )值下降较少,其饱和光强为1 200 μmol.m-2.s-1 , 比原种高200 μmol.m-2.s-1 , 光饱和光合速率比原种高50% 以上, 叶绿素含量和组分的衰减较慢, O2- 的产生速率较低, 丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)积累较少, 维持了较稳定的PSII 活性和光合能力, 表现出耐光抑制和光氧化的特性。转双基因PEPC+PPDK 的水稻株系在光氧化条件下, 它们的叶绿素和蛋白质含量下降较少, 同样表现出耐光氧化特性。张谦等 (2005)[14]研究表明, 转入PEPC 基因于水稻中有利于诱导提高其抗逆境酶的活性, 如SOD和POD的活性, 从而加速清除逆境中形成的活性氧, 这可能是转PEPC 基因水稻耐光抑制的生理基础之一。
可见将C4 光合固碳相关基因导入水稻, 在干旱和高光强等逆境条件下可以提高水稻的光化学效率和抗光氧化的能力, 启示我们将常规株型育种和转C4光合酶相关基因水稻耐光氧化种质选择相结合, 可能是进一步提高水稻的光合能力和减轻光氧化, 防止其早衰的一条有效途径。
本实验采用聚乙二醇溶液模拟PEG进行水分胁迫处理通过观察PEP 基因水稻和野生型水稻WT研究PEG胁迫对水稻光合生理特性的影响, 研究在PEG处理前、PEG处理后2个阶段的水稻幼苗叶片中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化氢酶（CAT） 等保护酶系活性的变化及丙二醛 MDA 、叶绿素和光合速率变化。
1 材料与方法
1．1 试验材料
本试验以转PEPC基因水稻为试验材料 , 以原种水稻Kitaake（WT）为对照。
1．2 处理方法
1. 2. 1 选种 选饱满且无菌斑的种子为宜
1. 2. 2 消毒 用1%升汞浸泡种子20min，然后用清水冲洗3—4遍
1. 2. 3 浸种 将消毒完的种子用水浸种置于恒温箱中目的是使种子破胸（温度设为300C）
1. 2. 4 催芽 置于恒温箱培养2天，温度设为20-250C（注意防止种子干燥，适时补充水分）
1. 2. 5 移栽 用Hongland培养法将各品种种植于培养皿中,在光强 4000lx、温度 25 ±2℃的人工气候箱中培养,每天光照 12h,生长至 4叶一心,供PEG处理之用。
1. 2. 6 处理 将供试材料分为两组,一组于原培养箱中继续生长另一组移至37℃进行PEG胁迫处理 48h;然后移回原培养箱恢复生长 2d,分别于PEG处理前、PEG处理后取材,测定生理生化指标。
1. 3 制备粗酶液
取叶片0.1g，放入预冷的研钵中，加入8 ml 50 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA），少量石英砂和PVP冰浴中研磨匀浆，4℃，10500×g离心20 min，上清液即为粗酶液。
1．4 生理生化指标的测定
1．4．1 过氧化物酶 POD 活性测定
按Kochba等的方法[26],配制50ml 0.1 mol/L pH6.0的磷酸缓冲液中加入愈创木酚 28 ul、 30%H 2O 2组成反应液,取3ml反应液加1ml粗酶液，立即开启秒表记时，以每分钟增加 0.01个 A470的酶量为一个酶活力单位;酶活性以“△OD470/min·mg鲜重表示
1．4．2 超氧化物歧化酶 SOD 活性测定
参照Giannopolitis和Ries的方法 [27]，在盛有3 ml反应混合液（在54 ml 14.5 mmol/L 甲硫氨酸中分别加入均以50 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液配制的3 μmol/L EDTA，2.25 mmol/L NBT和60 μmol/L 核黄素各2 ml，各个溶液均在用前配制，避光放置）试管中，加入适量的SOD粗酶液，混合后入在透明试管架上，在光照培养箱内200 μmol/m2·s照光10 min，黑暗下终止反应，迅速测定A560值，以不加酶液的照光管为对照，以抑制前50%的NBT光化还原作为一个酶活性单位。
1．4．3 丙二醛 MDA 含量测定
根据Heath[28]等的方法测定。将1.5ml粗酶液加入2.5ml0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液，混合物于100oC水浴上加热30min，迅速冷却，离心10min。上清液测定532nm的光密度值,MDA以umol/g表示。
1．4．4 过氧化氢酶 CAT 活性测定
参考Beers[29]等紫外分光光度法，并加以改进。在恒温条件下，在试管中加入0.067mol/L的磷酸缓冲液（PH7.0）2.9ml，其中含有H2O2，在加入0.1ml酶液，计时并立即用紫外分光光度计测定240nm的光密度值。（每10秒读一次，共一分钟），即以每分钟增加 0.1个 A240的酶量为一个酶活力单位;酶活性以“△OD240nm/min·mg鲜重表示
1．4．5 叶绿素含量的测定
叶绿素含量采用无水乙醇的方法测定[30]即取0.1g剑叶+95%的乙醇，放置在黑暗的环境下48小时即可。分别在 649nm 和 665nm下测定光密度值
1. 4. 6 光合速率的测定
用光合仪测定PEG胁迫前后PEPC及WT水稻幼苗
1．5数据分析 全部数据统计分析在 Excel2003软件上进行。
2 结果与分析
2.1 PEG胁迫前后转基因水稻和原种幼苗体内SOD活性的变化
活性氧在植物体内的清除是由保护酶和抗氧化物质来完成。SOD是保护酶中的最关键的酶,它可把毒性较强的O2-转化为H2O2,然后由POD将H2O2分解为H2O和O2。图1示转基因水稻PEPC以及原种WT苗期PEG处理后SOD活性的变化。从图可以看出在PEG处理前PEPC中的SOD活性高于WT中SOD的活性。经过PEG（白天38oC，夜间30oC）处理后发现WT体内的SOD活性提高幅度低于PEPC转基因水稻。这在一定程度上表明PEG处理加剧了它们的氧化伤害，从而较高水平地启动抗氧化酶的保护系统且转基因水稻体内活性氧清除系统的功能相对要高于非转基因水稻，反映了PEPC受自由基损伤程度要低于WT。
3 讨论
高等植物在光合类型上可分为C3、C4、CAM三大类。C4和CAM植物是在逆境条件下经过长期驯化，从C3植物进化而来的。与C3植物相比，C4植物由于具有CO2浓缩机制，能在高光强、干旱及低浓度CO2、干旱等条件下，比C3植物有较高的光合能力[12]和营养、水分利用效率，生物学的产量也较高(Brownetal.,1986)。进入20世纪90年代,由于分子生物学的发展和转基因技术的不断完善,已先后成功地将C4植物的C4光合酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC基因)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK基因)和NADP苹果酸酶基因(NADP-ME基因)等关键基因导入C3植物水稻,获得了转基因水稻植株[13,15]。
生物体通过SOD、POD和CAT三者协同作用,使自由基维持在一个低水平,从而防止自由基伤害,使需氧生物得以生存,故SOD、POD和CAT三种酶被称为保护酶系统。SOD能以超氧阳离子为基质进行歧化反应,从而清除植物组织和细胞内的超氧阳离子自由基,减缓氧自由基对细胞膜的损伤;CAT可以分解H2O2;POD主要起到酶促解H2O2的作用,解除细胞内有害自由基。而丙二醛是膜脂过氧化的最终产物,MDA直接影响到膜上结合酶的比例和活性,过量的MDA使代谢失调,细胞失去正常的调节功能,对细胞产生毒害作用。前人研究认为在逆境下,细胞内自由基平衡体系的维持对植物的抗性而言是至关重要的。MDA作为膜脂过氧化的最终产物,能够抑制细胞保护酶活性和降低抗氧化物的含量,从而加剧了膜脂过氧化。MDA本身也是具有细胞毒性的物质和酶结合、交联而使之失去活性,就进一步地破坏了膜结构。光合速率以单位时间、单位光合面积固定的CO2或释放的O2或积累的干物质的数量来表示。光合速率高低受光、温度、水分等的影响。PEG胁迫下，水稻光合速率降低。C4植物高的光合速率的基因，转入了PEPC水稻中，表达出C4水稻较高的光合能力的特性，，所以PEPC在干旱下光合速率比WT高。
转基因水稻与原种在PEG处理前后水稻幼苗的SOD，CAT，POD活性和MDA及叶绿素含量进行了测定。本文的研究结果表明：PEG胁迫后水稻幼苗的保护性酶活性均增加，保护酶通过共同的增加来抵御逆境产生的危害，转基因水稻的保护性酶活性增加的幅度均大于原种的幅度，转基因水稻幼苗中MDA的含量降低度大原种的幅度，这可能是由于测定MDA浓度的时间间隔过长，导致体内保护酶将水稻产生的抗逆性产物清除的缘故。同时叶绿素a含量的变化趋势与总叶绿素含量的变化均呈下降趋势，但是下降的幅度比总叶绿素的幅度大。叶绿素b含量的变化与总叶绿素和叶绿素a含量的变化趋势相似。但是叶绿素下降的幅度较叶绿素a小，可以说明干旱对光系统反应中心色素蛋白复合体的伤害大于集光色素蛋白复合体，同时与原种相比可以看出，转C4光合酶基因水稻的集光色素蛋白复合体受到伤害较轻。可见转基因水稻幼苗的耐光氧化能力的增强与C4基因的导入有关。已有研究表明，C4植物玉米比C3植物水稻耐光氧化[13]。
由此看来，转C4光合基因水稻保护酶在干旱条件下有显著诱导增加的表现，也暗示着C4基因的导入确实赋予了水稻某些C4光合特性，这可能是转C4光合酶基因水稻幼苗耐干旱的原因之一。这可能为我国水稻耐PEG育种提供理论依据。C4基因聚合在水稻中，其苗期表现出一定的C4 植物的抗PEG氧化的特性，那么在整个生育期是否能够一直保持耐干旱的特性是值得进一步研究的问题。